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支原體的分離培養(yǎng)方法及常用培養(yǎng)基

更新時(shí)間:2017-06-06      點(diǎn)擊次數(shù):3004

  支原體常用培養(yǎng)基為PPLO,很多公司都有出售。但血清(常用馬血清或豬血清)和抗生素(醋酸跎)需要自己添加。

在液體培養(yǎng)基中通常要加入酚紅做指示劑的,當(dāng)培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色時(shí),即可判定支原體的生長程度。需要注意的是,支原體的分離可能不太容易,需要多盲傳幾代。液體培養(yǎng)基變黃后,在固體培養(yǎng)基上單克隆,以純化分離的支原體。

一、支原體的培養(yǎng)條件

支原體的培養(yǎng)37°C即可。初次分離培養(yǎng)時(shí),在37°C,5-10% CO2條件下效果更好。

二、支原體的鑒定

主要靠菌落染色、生化反應(yīng)及特異性生長抑制試驗(yàn)等。

(1)Dienes菌落染色

Dienes染色液:

美藍(lán):2.5g

天青-II:1.5g

麥芽糖:10g

碳酸鈉:0.5g

蒸餾水:100ml

染色時(shí),直接吸染色液覆蓋菌落,1min后,用生理鹽水洗去染色液,低倍鏡下可見支原體菌落呈藍(lán)色,而其他菌菌落不著色。

(2)生化反應(yīng)

根據(jù)不同采樣部位及對底物的分解或者作為能源,可以鑒別不同支原體。

解脲支原體分解尿素不分解精氨酸,生成NH3使培養(yǎng)基的ph升高,酚紅指示劑變紅。

人型支原體分解L-精氨酸不分解尿素,生成NH3使PH值升高,酚紅指示劑變紅。

肺炎支原體分解葡萄糖,使pH降低,酚紅指示劑由紅變黃。

(3)在含0.002%美藍(lán)的培養(yǎng)基中肺炎支原體能生長且將美藍(lán)還原而退色,其他口腔、唾液或發(fā)酵支原體均被抑制生長,此法可鑒定肺炎支原體。

三、常用的支原體培養(yǎng)基配方

(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基

Hayflick培養(yǎng)基(PPLO培養(yǎng)基),牛心粉50g,蛋白胨10g,氯化鈉5g,加14g瓊脂粉為固體培養(yǎng)基。

(2) 肺炎支原體培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基 70ml

牛血清 (滅活) 20ml

25%的酵母浸液 10ml

50%葡萄糖 1-2ml 0.4

酚紅 0.5ml

制霉素 0.001g

青霉素 10萬IU

pH 7.8

(3)人型支原體培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基 70ml

馬血清 20ml 25%的酵母浸液 10ml

30% L-精氨酸 0.33ml

0.4%酚紅 0.5ml

制霉素 0.001g

青霉素 10萬IU

pH 6.3

(4)解脲支原體培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基 70ml

馬血清 20ml

25%的酵母浸液 10ml

30%尿素0.33ml

0.4%酚紅 0.5ml

制霉素 0.001g

青霉素 10萬IU

pH 6.0

注:支原體能在人工培養(yǎng)基上生長,但是營養(yǎng)要求較高,需要提供膽固醇和酵母才能生長。以上配方中,馬(牛)血清提供膽固醇,酵母浸液提供酵母。

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